Introducción:

        La PCR (del inglés, Reacción en Cadena de la Polimerasa) es un técnica in vitro para la amplificación (síntesis) enzimática de fragmentos específicos de ADN. Se utilizan “primers” que hibridan las cadenas de ADN complementarias (opuestas) y flanquean la región de interés (target).

        La PCR permite la amplificación exponencial de una secuencia o target. Dicha amplificación permite la obtención de miles de millones de copias de dicha secuencia a partir de unas pocas moléculas de ADN. La especificidad de la secuencia a amplificar viene dada por unas moléculas cortas de ADN (de entre 10 y 30 pares de bases) denominadas “primers” u oligonucleótidos. Diferentes primers son capaces de amplificar distintas regiones del mismo molde o incluso distintos moldes. La PCR está compuesta por una seria de ciclos, donde en cada ciclo primero se realiza una desnaturalización del ADN molde con temperaturas cercanas a los 95°C, luego una etapa de hibridación de los “primers” (cuya temperatura oscila entre los 50 y 65°C, dependiendo de los primers) y una tercera etapa donde ocurre la reacción de polimerización. Luego de la última etapa, se repite el ciclo entre 30 y 40 veces. Por último, los productos de PCR pueden ser visualizados en geles de agarosa.

        La PCR en tiempo real es una variante de la PCR, donde la aparición de producto es detectada y mostrada en cada ciclo de amplificación por un equipo que detecta fluorescencia. Se utilizan reactivos fluorescentes que en la unión con el ADN fluorescen a una longitud de onda determinada, que el lector del equipo es capaz de detectar. A medida que ocurre la amplificación, la fluorescencia aumenta con la cantidad de producto que se forma (figura 1).

Figura 1: Fluorescencia en función de los ciclos de PCR.

        Una vez que se termina la reacción de PCR, se realiza un análisis denominado Curva de Melting, donde se somete el producto a temperaturas crecientes y se va detectando fluorescencia. Hay una determinada temperatura, que dependerá del amplicón, a la cúal el fluorósforo se libera del ADN y hay una caída abrupta de la fluorescencia. Esa temperatura se denomina Temperatura de Melting (Tm) y depende del tamaño del amplicón, de las bases del mismo, del equipo utilizado y los reactivos. Es una forma de poder determinar si lo que se ha amplificado es lo que uno espera. La Tm de cada amplicón debe determinarse de forma empírica.
Diagnóstico de Enfermedades Venéreas:

    Tritrichomonas foestus y Campylobacter fetus son dos microorganismos capaces de colonizar el tracto genital bovino y provocar infertilidad, muerte embrionaria y aborto en las hembras. Las técnicas tradicionales permiten la identificación de animales infectados con ambos patógenos. Para la determinación de C. fetus se utiliza la técnica de Inmunofluorescencia Directa (IFD) y para T. foetus se utiliza una microscopía de campo claro sobre cultivos en medio selectivo (se realizan observaciones diarias durante 7 días).

    Según datos del Laboratorio Serivet SRL, la tasa de infección promedio fue de: 0.58% para T. foetus y de 0.45% para C. fetus en los últimos 10 años. Sin embargo, al analizar los establecimientos afectados para el caso de T. foetus alcanza el 20.4% y para C. fetus el 28.41%. Teniendo en cuenta que no es frecuente que ambas enfermedades se encuentren en el mismo establecimiento, casi la mitad de los establecimientos analizados han tenido al menos un caso positivo para alguna de las enfermedades en los últimos 10 años.

        Según la Resolución (MDA) 298/22, donde se aprueba “Plan Oficial de Prevención y Erradicación de las Enfermedades de transmisión sexual (ETS) en bovinos” para la PBA; en su artículo N° 6 dispone: “Serán considerados válidos aquellos diagnósticos realizados mediante las técnicas de detección directa de los agentes causales por microscopía a través de su multiplicación en medios de cultivo, inmunofluorescencia directa (IFD) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sea bajo la técnica convencional y/o en tiempo real (q-PCR)”. Para certificar que un rodeo sea negativo se necesitan: a) Dos diagnósticos negativos por técnicas convencionales (IFD y cultivo), separadas por 15 días entre muestras o b) Un diagnóstico negativo por técnica de PCR (en cualquiera de sus variantes).
        En la provincia de Buenos Aires, no hay un protocolo establecido y unificado para hacer PCR en los diferentes laboratorios habilitados. Cada laboratorio tiene su propio protocolo, desde distintos métodos de extracción del ADN, pasando por diferentes químicas de reacción y enzimas, hasta equipos distintos. Esto dificulta la comparación de datos entre distintos laboratorios y no permite un costo uniforme entre los distintos laboratorios de la provincia.

Diagnóstico Molecular de enfermedades venéreas en el laboratorio Serivet SRL

        En el Laboratorio de Diagnóstico Molecular al momento se realizan las determinaciones por PCR de las enfermedades causadas por T. foestus y C. fetus. El protocolo del diagnóstico está separado en etapas que se muestran en la figura 2.

Figura 2: Flujo de trabajo para la detección de enfermedades venéreas por PCR

        Todas las etapas están separadas temporal y espacialmente. Cada etapa se realiza en una parte del laboratorio separada del resto. Esto es de suma importancia para evitar contaminaciones. Las muestras ingresan al laboratorio en tubos de plástico con 1 ml de PBS. Cada muestra es calificada a ojo desnudo entre 1-4, dependiendo de lo limpia que venga la muestra, donde 1 es traslúcida o con mucosa solamente a 4 donde viene sucia con tierra y materia fecal (figura 3). Cerca del 80% de las muestras ingresadas en el año 2023 están en la categoría 1 y 2.

Figura 3: Proporción de los estados de las muestras ingresadas (N total: 1667)

        Las muestras son procesadas para lograr la extracción de ADN de calidad. Durante el año 2023 hemos estado utilizando un kit comercial para la purificación de ADN. El ADN extraído es analizado por medio de un espectofotómetro para determinar la cantidad y calidad del mismo. Para determinar la calidad del ADN extraído se mide la absorbancia a dos longitudes de ondas diferentes dentro del espectro del UV. La relación entre ambas absorbancias determina la calidad de la muestra. Relaciones entre 1.6-2.2 indican un ADN puro, y adecuado para posteriores análisis moleculares. Como se muestra en la figura 4, la pureza de la extracción tiene una relación con la calidad de muestra ingresada.

Figura 4: Relación 260/280. Se muestran promedio ± error estándar.

        Todas las muestras luego ingresan al sector de PCR donde se realiza la reacción enzimática propiamente dicha. Hoy en día estamos utilizando una enzima comercial (de marca nacional), junto a unos primers comerciales (para T. foestus) y primers de desarrollo propio (para C. fetus). La reacción de PCR es armada en un flujo laminar y luego se lleva a un cuarto separado donde se encuentra el equipo de PCR para realizar la corrida y lectura de la PCR. Una vez finalizada la lectura, las placas se descartan para evitar que vuelvan a otros sectores del laboratorio como se explicó anteriormente. En cada corrida donde se analizan las distintas muestras, se deben agregar controles positivos (de muestras previamente determinadas como positivas) como controles negativos (de muestras previamente determinadas como negativas). Si alguno de los controles falla, se debe repetir la corrida. Toda muestra que tenga un Ct menor a 38 y que el pico de Tm coincida con los controles es considerada positiva. Por cuestiones de seguridad, toda muestra positiva es reanalizada en la siguiente corrida.

    En el año 2022 se analizaron 946 muestras para C. fetus (con una positividad de 2.64%) y 442 muestras para T. foestus (con una positividad de 5.43). Hay que destacar que dicho año se analizaron principalmente muestras que provenían de establecimientos problemas. En el año 2023 se incrementó la cantidad de muestras analizadas, realizándose 1994 determinaciones para C. fetus (con una positividad de 1.45%) y 1279 (con una positividad de 1.17%). El aumento de determinaciones junto con la baja de positividad se explica por el análisis de no solamente establecimientos problemas, sino por el análisis de rodeos con antecedentes y sin información. Ver figura 5 para conocer nuestro concepto para establecimientos problema, y rodeos con antecedentes y sin información.

    Todas las muestras que fueron procesadas y analizadas por PCR, también fueron analizadas por técnicas tradicionales, por lo tanto, es posible realizar una comparación entre ambas metodologías. Hay que tener en cuenta, que al contar con pocas muestras que fueron positivas por PCR, las conclusiones que se pueden obtener no son completas, y se deberá contar con un mayor número de muestras para poder obtener una conclusión más robusta. Los datos obtenidos durante el 2023 serán sumados a los datos que se obtengan en los años subsiguientes para tener un mayor número de muestras. Sin embargo, se pueden obtener conclusiones parciales con los datos obtenidos hasta el momento.

    Como se puede observar en la tabla 1; la mayoría de los datos fueron negativos para ambas técnicas realizadas (N: 1650) para el análisis de C. fetus. 7 muestras fueron catalogadas como positivas por ambas técnicas, mientras que 3 muestras fueron detectadas por PCR solamente.

Tabla 1: Comparación entre técnica tradicional (IFD) y molecular (PCR) para C. fetus

    En el caso de T. foetus, los resultados fueron similares (tabla 2). Todas las muestras positivas fueron detectadas por PCR. 1 de las 3 muestras que fueron detectadas por PCR y no por cultivo, fue muestreada nuevamente y dio positivo por ambas técnicas. Hay dos muestras que dieron sospechosas por cultivo, que dieron negativas por PCR (posiblemente TetraTricomona). Los primers para la detección de T. foetus discriminan género y especie.

Tabla 2: Comparación entre técnica tradicional (cultivo) y molecular (PCR) para T. fetus

    Es de suma importancia destacar que el uso conjunto de las técnicas tradicionales y el diagnóstico molecular, amplía el rango de detección y mantiene una alta seguridad diagnóstica que termina teniendo una importante incidencia en la Sanidad Animal.

Recomendaciones del Laboratorio:
    Una de las preguntas que más nos han realizado los veterinarios durante el año 2023 es: “Cuándo conviene realizar un diagnóstico por técnicas tradicionales y cuando aplicar PCR?”. Para resolver esa cuestión hemos diseñado un “triángulo de Riesgo”, que se detalla en la figura 1, el cual se recomienda la técnica de diagnóstico que nosotros recomendamos para cuatro situaciones:
                Situación IV (Riesgo Muy Alto): Rodeos problemas: rodeo con animales positivos a enfermedades venéreas y/o con antecedentes, es decir, que hayan detectado positivos en muestreos anteriores. Realizar 2 muestreos con Diagnóstico Tradicional y diagnóstico por PCR.

            Situación III (Riesgo Alto): Rodeos expuestos con antecedentes de años anteriores o en rodeos que no se cuente con información previa. Realizar 2 muestreos con Diagnóstico Tradicional y Diagnóstico por PCR.

                Situación II (Riesgo Moderado): Rodeos expuestos sin antecedentes. Realizar un primer muestreo con Diagnóstico Tradicional y Diagnóstico por PCR. En caso de obtener resultado negativo, realizar un segundo muestreo solo con la Técnica Tradicional.

                Situación I (Riesgo Bajo): En rodeos vírgenes y no expuestos, realizar dos muestreos con Técnicas Tradicionales.

Figura 5: Triángulo de riesgo vs enfermedades venéreas.

    Es importante destacar que si en cualquiera de los rodeos en situaciones III, II y I, apareciera un positivo, cambia automáticamente al estado de situación IV, donde se deben realizar nuevos muestreos, hasta obtener dos resultados negativos por ambas técnicas para la enfermedad problema para declarar al rodeo sano contra estas enfermedades.

Conclusiones:

    Durante el 2023 hemos implementado mejoras con el fin de optimizar la relación precio/calidad en el diagnóstico. Hoy en día estamos utilizando unos kits de PCR de producción nacional junto a unos primers para T. foetus también de origen nacional y unos primers para C. fetus de diseño propio. Estamos optimizando los métodos de extracción para optimizar los costos manteniendo la alta calidad del ADN extraído con resultados muy alentador para utilizar en la campaña 2024.

    El diagnóstico por PCR ha mostrado ser tan eficiente como las técnicas tradicionales. Ha sido útil para diferenciar entre Trico y Tetra en casos sospechosos. Al momento es un gran complemento a las técnicas tradicionales. El obtetivo de Serivet SRL sigue siendo:
    "Mantener la alta precisión diagnóstica, reduciendo los costos (que permitan extender y masificar el uso de la PCR) y utilizando insumos nacionales y/o desarrollo propio (para garantizar a lo largo del tiempo el mantenimiento de la alta calidad)."